Cancer Cell Int. 2022 Nov 15;22(1):352.
Katase N, Nishimatsu S, Yamauchi A, Okano S, Fujita S.
Abstract
Background: Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the most common malignant tumor of the head and neck. We identified cancer-specific genes in HNSCC and focused on DKK3 expression. DKK3 gene codes two isoforms of proteins (secreted and non-secreted) with two distinct cysteine rich domains (CRDs). It is reported that DKK3 functions as a negative regulator of oncogenic Wnt signaling and, is therefore, considered to be a tumor suppressor gene. However, our series of studies have demonstrated that DKK3 expression is specifically high in HNSCC tissues and cells, and that DKK3 might determine the malignant potentials of HNSCC cells via the activation of Akt. Further analyses strongly suggested that both secreted DKK3 and non-secreted DKK3 could activate Akt signaling in discrete ways, and consequently exert tumor promoting effects. We hypothesized that DKK3 might be a specific druggable target, and it is necessary to establish a DKK3 inhibitor that can inhibit both secreted and non-secreted isoforms of DKK3.
Methods: Using inverse polymerase chain reaction, we generated mutant expression plasmids that express DKK3 without CRD1, CRD2, or both CRD1 and CRD2 (DKK3ΔC1, DKK3ΔC2, and DKK3ΔC1ΔC2, respectively). These plasmids were then transfected into HNSCC-derived cells to determine the domain responsible for DKK3-mediated Akt activation. We designed antisense peptides using the MIMETEC program, targeting DKK3-specific amino acid sequences within CRD1 and CRD2. The structural models for peptides and DKK3 were generated using Raptor X, and then a docking simulation was performed using CluPro2. Afterward, the best set of the peptides was applied into HNSCC-derived cells, and the effects on Akt phosphorylation, cellular proliferation, invasion, and migration were assessed. We also investigated the therapeutic effects of the peptides in the xenograft models.
Results: Transfection of mutant expression plasmids and subsequent functional analyses revealed that it is necessary to delete both CRD1 and CRD2 to inhibit Akt activation and inhibition of proliferation, migration, and invasion. The inhibitory peptides for CRD1 and CRD2 of DKK3 significantly reduced the phosphorylation of Akt, and consequently suppressed cellular proliferation, migration, invasion and in vivo tumor growth at very low doses.
Conclusions: This inhibitory peptide represents a promising new therapeutic strategy for HNSCC treatment.
＜研究の概要＞
検証項目：HNSCCで腫瘍細胞の悪性度を規定するDKK3の働きを阻害することで腫瘍制御が可能か？
この目的を達成するために、DKK3の機能ドメインを同定し、これを抑制するペプチドを開発して効果を検証する。
結果：DKK3の機能ドメインは２つのcysteine rich domainであり、その中のDKK3に特有のアミノ酸配列をターゲットとしたアンチセンス
ペプチドを合成したところ、低用量で腫瘍細胞の増殖・浸潤・遊走・腫瘍増大を有意に抑制できた。
前回の論文（Katase N et al. Int J Oncol. 2019）では、頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）細胞で
DKK3がAktの活性化を介して腫瘍細胞の悪性度を規定することを明らかにした。
その過程では、分泌型DKK3が何らかの受容体を介してAktを活性化する経路と非分泌型DKK3が
細胞内でAktを活性化する経路が考えられた。
従って、DKK3をターゲットとした創薬実現には、DKK3とエフェクタータンパクの間の相互作用を
阻害することが必要であると考え、DKK3機能ドメインに対するアンチセンスペプチドを作製し、
検証することとした。
(1) DKK3機能ドメインの同定
まず、DKK3が機能を発揮するために必須となる機能ドメインの同定を行った。
機能ドメイン候補として2つのcysteine rich domain (CRD1, CRD2)に着目、
これらを削除したdeletion mutant発現プラスミドをHNSCC細胞に導入したところ、
DKK3によるAktのリン酸化、細胞の増殖・浸潤・遊走の増加にはCRD1,
CRD2の両方を同時に阻害することが必要であることが示された。
(2) DKK3機能ドメインに対するペプチドの合成と検証
DKK3と他のDKKファミリータンパクのアミノ酸配列を比較することで、
CRD1, CRD2の中で機能の発揮に重要と考えられるアミノ酸配列を同定、
この部位に結合してタンパクの機能を阻害するアンチセンスペプチドを
蛋白化学研究所に受託してデザインした。
このペプチドとDKK3のモデルをRaptor Xで作成してClusPro2で
ドッキングシミュレーションを行い、最もスコアの良い組み合わせを選別した。
このペプチドをHNSCC細胞に加えたところ、100nMという低用量でAktの
リン酸化とそれに伴う腫瘍細胞の増殖・浸潤・遊走を有意に抑制することが
できた。さらに、ヌードマウス背部皮下に移植した腫瘍に対してペプチドを注入すると、
腫瘍細胞の増殖を有意に抑制できることも確認した。
以上から、DKK3をターゲットとしたアンチセンスペプチドにより腫瘍制御が可能であることを示した。
DKK3をターゲットとした創薬の実現が大きく前進した。
